N6A在鋼筋圖上表示什麼

❶ 廣聯達鋼筋算量軟體，屬性編輯好後，進入繪圖界面，圖元怎麼沒有了

親，那是因為你過濾了構件的。你如果不過濾的話就可以解決了。

❷ 基因工程研究中需要哪幾類酶，這些酶各有什麼作用

用於基因工程的工具酶
一,限制性內切酶(Endonucleosase)
(一)限制性內切酶(Endonucleosase)的發現與分類
1) 50年代初發現細菌能將外來DNA片段在某些專一位點上切斷,從而保證其不為外來噬菌體所感染,而其自身的染色體DNA由於被一種特殊的酶所修飾而得以保護,這種現象叫做限制-修飾,它們由三個基因位點所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年後,人們搞清了細菌的限制與修飾分子機理:
hsd R---限制性內切酶
hsd M---限制性甲基化酶
hsd S---控制兩個系統的表達
1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分離出兩個類內切酶,Hind II和Hind III,為基因工程技術的誕生奠定了基礎.
截止到目前為止,已經分離出400餘種II類酶,搞清識別位點的有300種,商品化的約有一百種,而實驗室常用的有二十種 .
2)限制性核酸內切酶可分為三大類:
I類 能識別專一的核苷酸順序,並在識別點附近切割雙鏈,但切割序列沒有專一性.
II類 識別位點(迴文序列)嚴格專一,並在識別位點內將雙鏈切斷
III類 識別位點嚴格專一(不是迴文序列),但切點不專一,往往不在識別位點內部.
因此在基因工程中具有實用價值的是II類限制性內切酶.
(二)II類限制性內切酶的命名及特性
命名原則:取屬名的第一個字母大寫,取種名的前兩個字母小寫,構成基本名稱.該種中發現的不同的酶按照順序編號I, II, III等.如存在變種和品系,取變種或品系的一個字母.若酶存在於質粒上,則需大寫字母表示非染色體遺傳因子.
如,HindIII從Haemophilus Influenzue d株中分離的第三個酶.EcoRI表示基因位於Escherichia coli中的抗葯性R質粒上.
(三)II類限制性內切酶的底物識別順序及切割位點
絕大多數的II類限制性內切酶在底物DNA上的識別順序長度為4,5,6鹼基對,這些鹼基對的順序呈迴文結構(Palindromic),而且切點就在其內部,如EcoRI 5'-GAATTC-3' .
DNA被限制性內切酶切開之後,呈現兩種斷口:
鈍端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等
粘端(粘性末端)如:EcoR I等
圖2-1 限制性內切酶產生的末端
(四)識別位點在DNA分子中的頻率
對於特定的限制性酶在DNA分子中的識別位點數目是可以計算的,四鹼基的酶平均大約每256個核苷酸(44)有一個識別位點,而六鹼基的酶大約4096(46)個核苷酸有一個識別序列,計算是在假定核苷酸隨機排列的情況下進行的.實踐中這種方法不完全正確,如λ DNA長49kb,對於六鹼基的酶應該有12個切割位點,實際上要少一些,如Bgl II只有6個,BamHI只有5個,而SalI只有2個.
二,甲基化酶
在專一位點上甲基化,與限制性內切酶相對應.
(一)大腸桿菌中的甲基化酶
dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,這樣可使一些識別順序中含有5'GATC3'的限制性內切酶不能切割來自大腸桿菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)則不會因為N6A的甲基化而失去活性,因為這兩種酶對底物的特異性不同.
dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影響的限制性內切酶是EcoR II.
(二) 甲基化酶在基因工程中用途
許多II類限制性內切酶,都存在著相對的甲基化酶,它們可修飾限制酶識別順序中的第三位腺嘌呤上,封閉酶切位點,從而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基轉移到EcoRI識別順序中的第三位腺嘌呤上,從而使DNA免受EcoRI的切割.
三,T4-DNA連接酶(T4-DNA Ligase)
來源於T4噬菌體感染的大腸桿菌,連接修復3'端羥基和5'端磷酸基因,脫水形成3'-5'磷酸二酯鍵
連接雙鏈DNA上的單鏈缺口(Nick),因此亦可連接限制內切酶所產生的粘性末端
連接RNA模板上的DNA鏈缺口
連接平頭雙鏈DNA速度很慢,在高濃度的底物和酶的作用下方可進行,這屬於分子之間的連接.
圖2-2 連接酶的作用方式
四,核酸酶
作用: 降解磷酸二酯鍵
分為:外切酶 內切酶
(一) Bal 31(來自於細菌Alteromonas espejiana) 單鏈特異的核酸內切酶活性,雙鏈特異的內切酶活性.依賴於Ca2+
用途:
構建限制酶圖譜
產生末端缺失突變
DNA超螺旋線性化
(二)E. coli外切酶III
只降解DNA分子的一條鏈,產生單鏈的DNA分子.
(三)S1核酸酶(來源於米麴黴菌)
特性:
1. 降解單鏈DNA或RNA,降解DNA的速度大於降解的速度
2. 降解發生的方式為內切和外切
3. 酶切活性需4.0-4.5pH環境,Zn2+激活
4. 酶量過大時會降解雙鏈核酸,因為雙鏈降解活性比單鏈低75000倍
(四) DNase I: 來自於牛胰腺, 既可以降解單鏈也可以降解雙鏈,沒有特異性,產生單核苷酸或短鏈
五,聚合酶
(一)DNA聚合酶I
5'-3'聚合酶活性
3'-5'外切酶活性
5'-3'外切酶活性
核酸內切酶活性
可以被枯草桿菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5'-3'外切酶活性的分子.
圖2-3 DNA聚合酶I
(二) Klenow酶
該酶無5'-3'外切活性,保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性,基因工程中利用該酶:
修復限制性內切酶造成的5'突出的粘性末端
標記DNA探針
催化cDNA第二條鏈的合成
末端終止法測序
圖2-4 Klenow 酶的作用方式
(三) T4 DNA聚合酶
與Klenow酶相似,外切酶活性更高.體外誘變反應中效率很高.
(四)T7 DNA聚合酶
測序酶
(五) Taq DNA聚合酶
耐高溫,主要用於PCR反應.
(六) 逆轉錄酶:將mRNA轉錄成cDNA
AMV逆轉錄酶(鳥類成髓細胞性白血病病毒)
DNA聚合酶活性
RNase H活性
DNA內切酶活性
核酸結合活性
M-MLV逆轉錄酶(Moloney鼠白血病病毒)
兩種逆轉錄酶的區別
肽鏈的組成
禽酶2條肽鏈,具聚合酶和很強的RNase H活性
鼠酶1條,較弱的RNase H活性
反應的最適溫度
禽酶42°C,二級結構豐富RNA,禽酶效率高
反應的最適pH值
禽酶pH 8.3
鼠酶pH 7.6
六,DNA修飾酶
有大量的修飾酶,主要的有以下幾種:
1) 鹼性磷酸酯酶(來自於大腸桿菌或小牛腸道)可以去掉DNA分子的5'端的磷酸基團.
2) polynucleotide kinase: 來自於T4侵染的大腸桿菌,在5'端增加磷酸基團.
3) 末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl tansferase) 來自於小牛胸腺組織,在DNA分子的3'端增加一個或多個脫氧核苷酸.
4) Topoisomerase改變共價閉合雙鏈DNA分子的結構
第二節 DNA的切割反應
一,緩沖系統的組成
II類酶的酶活條件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM
根據不同酶對鹽離子要求不同,可將緩沖液分為以下三種情況:
高鹽:100-150mM
中鹽:50-100mM
低鹽:0-50mM
二,酶切操作
DNA量的確定,加入酶量的確定,發應體積的確定(20μl),反應時間的確定,1-1.5hr,一般為37℃,但也有例外,如Taq I在65°C時活性最高.
單位限制性內切酶定義為:在最佳緩沖系統和20μl體積中反應1小時,完全水解1μgDNA所需的酶量.
三,酶切結果分析
(一) 酶切片段的檢測
1) 通過凝膠電泳分離,根據分子量分離.根據凝膠的濃度可以分離不同分子量的片段,聚丙烯醯胺凝膠電泳可以分離1-300bp的分子.
2) DNA分子的檢測 a. 染色EB,DNA分子小於25ng,很難檢測到
b. 放射性自顯影, 可以監測少到2ng DNA分子.
(二)估計DNA分子的大小
根據DNA分子的遷移率,可以用公式計算出分子量D=a-b(logM)
D是移動的距離,M是分子量,a, b是恆量但隨著電泳條件的改變而改變.
也可以根據已知大小的片段進行比較,誤差約在5%左右.
四,多酶聯合酶解
對於對濃度要求相同的酶,原則上可以同時酶解;
對於對濃度要求不同的酶,可以:
1. 低鹽濃度的酶先切,後補加NaCL
2. 一種酶切後,換緩沖液,加5mM NaAc 0.1體積,2體積乙醇,冰浴5min,4℃離心10min,乾燥
五,定位酶切位點
建立酶切圖譜需要一系列的酶.
首先確定每一種酶切後產生的分子量和片段的數目;
然後進行雙酶切;
比較酶切和雙酶切的結果,繪制酶切圖譜;
含糊的位點可以通過部分酶切解決,可以短時間的酶切或者在4°C條件下進行.
六, 限制性內切酶的star活性
在PH不合適,或甘油濃度過高≥10%時,限制性內切酶的切割位點會出現非專一性,因此應確保酶的體積為總體積的十分之一以下.
第三節 DNA片段的連接
重組DNA分子構建的最後一步是連接,通過連接酶完成.相對而言,鈍端的連接效率較低,因此一般提高DNA濃度的方法增加接觸的機會.而粘性末端的連接效率較高,因為兩個粘性末端可以通過氫鍵鹼基互補配對.這種暫時的,鹼基配對結構可以提高連接的效率.在分子克隆的連接方式主要有以下幾種:
一,連接方式
(一)相同粘性末端的連接
來源:
相同的酶
同尾酶
問題:
極性有兩種可能
同尾酶連接後,不能用任何一種酶酶切.稱為"焊死".
(二)平頭末端的連接
粘性末端--分子內部連接,平頭末端--分子間的連接.
提高連接效率的方法:
加大酶用量(10倍)
加大平頭末端底物的濃度
加入10%PEG(8000),促進分子間的有效作用
加入單價陽離子, 150-200mM NaCl
提高反應溫度
平頭連接同樣存在兩種極性
(三)不同粘性末端的連接
突出5'末端
Klenow補平,或S1核酸酶切平,然後平頭連接
突出3'末端
T4-DNApol切平,然後平頭連接
突出末端不同
Klenow補平,或S1核酸酶切平
連接後,可能恢復限制性位點,甚至還可能產生新的位點.XbaI與HindIII( XbaI恢復), XbaI與EcoRI(均保留),BamHI與Bgl II(產生ClaI位點)
(四)人工粘性末端的連接
5'突出的末端
外源片段先用Klenow補平;然後用TdT補加polyC;載體片段也用Klenow補平,加polyG,退火不經連接即可轉化.目的是:不使酶切位點遭受破壞.
3'突出的末端
外源片段先用TdT加polyG;載體片段加polyC;然後退火;再用Klenow補齊;連接
平頭末端
可直接用TdT補加末端,但以加polyA/T為佳.這樣稍微加熱,AT區就會出現單鏈區域,然後用S1核酸酶水解即可回收片段
(五)粘端與平端的連接
linker : 人工合成的,含有限制性內切酶識別序列的,短的雙鏈DNA片段.
– 連接的效率較高
– 酶切時可能破壞DNA分子的完整.
adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸.
圖 2-5 linker的連接方式
(六)粘性末端的更換
在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口
– BamHI酶切片段用Klenow補平,或用S1酶切平;連接一段linker或Adaptor,使之產生EcoRI粘性末端.這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口 .
– 由AluI更換EcoRI:AluI切開,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切開,Klenow補平,連接,原來含有AluI的片段變成含有EcoRI
二,重組率
重組率:連接反應結束後,含有外源DNA片段的重組分子數與加入的載體分子數之比.較為理想的重組率為25-75%
提高重組率的方法:
連接反應條件 外源片段:載體=2:1-10:1(分子數),增加碰撞機會,減少自身環化.
載體除磷 (磷酸酯酶5'除磷).
TdT在3'端增加人工粘性末端,防止載體自我環化 .