Ⅰ 无缝克隆引物不含酶切位点设计原理
无缝克隆，让载体构建变得像搭积木一样简单
吴思涵
知芹余扰识星球「生物狗窝」，生物医学同行交流社区
前言
提起“克隆”、“载体构建”这两个词，似乎总会同时提到“限制性内切酶”。没错，在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，并通过碱基互补配对，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。
近年嫌旦来，“无缝克隆”逐渐受到科学家的欢迎。相比之下，无缝克隆操作更加简单，灵活性更强，同时几乎不受序列的限制，一次可定向组装高达10个片段的dsDNA。这篇文章将带大家认识无缝克隆的原理、优势和应用。
一、无缝克隆的原理
首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。由于Golden Gate assembly依赖于Type IIS限制性DNA内切酶（如BsaI，BbsI等），一旦载体不携带相应的识别序列，这种方法就走不通了。而假设通过PCR引入Type IIS内切酶识别序列，那便不是真毁宴正意义上的“无缝”了。因此本文所提的“无缝克隆”，特指Gibson assembly流，不涉及任何Golden Gate及其他流派。
目前，无缝克隆比较著名的商品化名字有NEB家的Gibson Assembly和NEBuilder HiFi DNA Assembly，Clontech家的In-Fusion，以及Invitrogen家的GeneArt等。但无论叫什么名字，其基本原理都和早期的Gibson assembly的是一样的。
与传统的双酶切克隆一般，无缝克隆同样需要依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，并利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口（nick）。但是，无缝克隆并不使用“内切酶”来制造黏性末端，而是通过“外切酶”来产生的。
（Tips 1：“内切酶”是在核酸链内部进行“一刀两断”剪切的酶，而“外切酶”是在核酸链的末端、即外部进行“逐个碱基”剪切的酶）
在无缝克隆中使用的外切酶是T5核酸外切酶，它能沿着5’→3’方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端。
（Tips 2：T5外切酶同时具有ssDNA外切酶活性，但并不降解超螺旋dsDNA。）
读到这里大家应该能想到，假设要拼接的两个片段的末端，是一模一样的碱基序列，那么通过T5外切酶，就能产生几乎一致的黏性末端了。没错，无缝克隆的原理便是如此。如下图所示，假如我们需要将3个片段按照1→2→3的顺序拼接起来，只需要保证1的末尾和2的开头，以及2的末尾和3的开头，具有同样的序列即可（我们可称之为同源臂）。这个同源臂序列，并不是额外添加进去的，而是载体或者拼接片段本身携带的。也就是说，我们可以通过PCR的方法，在外源拼接片段的两端加上线性化载体
Ⅱ 🔬实验 | 分子克隆实验——无缝克隆
无缝克隆原理
在载体末端和引物末端应具有15-25个同源碱基（同源臂）。通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶，三种酶同时发挥功能，从而达到单片段或多片段与载体连接的技术。
T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，形成粘性末端；DNA聚合酶：填补缺口；DNA连接酶：两条DNA 单链黏合起来。
无缝克隆特点
对比传统分子克隆与无缝克隆的实验流程
1. 载体制备
载体的线性化：酶切（单酶切、双酶切）或反向 PCR 扩增。
酶切制备推荐双酶切方法进行，单酶切则需要去磷酸化；酶切完成后，需失活快速内切酶或将产物进行纯化。
反向 PCR 扩增制备线性化载体需设计载体末端引物，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增，使用预线性化的质粒作为模板。
2. 插入片段制备
引物设计原则：使用PCR扩增方法获得目的片段，引物5' 端需包含与其相邻片段末端同源的15~25nt（推荐18nt），以保证扩增产物的5' 端和3' 端分别与相邻片段形成重叠序列。
插入片段正反向扩增引物设计：正向引物包含载体末端正向同源序列、酶切位点和基因特异性序列；反向引物包含基因特异性序列、酶切位点和载体末端反向同源序列。
制作最终序列图谱，可使用在线设计工具或SnapGene软件。
3. 无缝克隆体系配制与反应
计算最适载体和片段用量，注意长度影响。体系反应需在50℃进行，反应时间5~60min，然后离心冷却，准备转化或储存。
4. 转化与克隆筛选
转化感受态细胞，将重组产物与细胞混合，42℃热激后置于37℃培养，菌落PCR或酶切法鉴定。
实验注意事项
推荐使用高效率感受态细胞进行转化，避免使用未纯化PCR扩增产物，以质粒为模板进行PCR扩增后，使用 DpnI 消化处理时需失活 DpnI，以避免降解重组载体。